Дослідження співвідношення в м`язах С-і Х-білків у нормі і при патології

2.4. Вивчення амілоїдних фібрил in vitro

Спочатку, амілоїдні фібрили вивчали, виділяючи їх з уражених амілоїдних відкладень. . В даний час для вивчення амілоїдних фібрил, а також амілоідогенеза їх формують in vitro. , 1999). Відкриття того, що амілоїдні фібрили формують не тільки білки, пов'язані з амілоїдозом, значно розширило цю область дослідження (Dobson, 1999). могут многие белки, такие как лизоцим, миоглобин, А β пептид, амилин, тау-белок, хангтингтин, мышечная ацилфосфатаза и др. ( Uversky & Fink 2004). Було показано, що при відповідних умовах утворювати амілоїдні фібрили in vitro можуть багато білків, такі як лізоцим, міоглобін, А β пептид, аміліна, тау-білок, хангтінгтін, м'язова ацілфосфатаза та ін (Uversky & Fink 2004).

Відзначено, що амілоідогенние білки мають різними здібностями до формування амілоїдів, що відбивається також в різній швидкості цього процесу. ., 1999) (рис. 6). Наприклад, м'язова ацілфосфатаза людини здатна формувати аморфні агрегати після перших годин інкубації і лише через 45 днів з'являються пучки фібрил (Chiti et al., 1999) (рис. 6). ., 2003), а образование фибрилл α- лактальбумина занимает несколько дней ( Goers et al ., 2002). А β (1-40) - пептид після 4 годин інкубації утворює аморфні агрегати, і тільки після 48 годин - довгі фібрили (Qahwash et al., 2003), а утворення фібрил α-лактальбуміну займає кілька днів (Goers et al., 2002 ).

., 2005). За швидкістю амілоідогенеза спостерігають за допомогою класичного амилоидного барвника тіофлавіна Т, який специфічно взаємодіє з амілоїдних фибриллами (Krebs et al., 2005). При взаємодії тіофлавіна Т з амілоїдних фибриллами відбувається збільшення інтенсивності флуоресценції барвника при спектрофлуорометріческіх вимірах і спостерігається жовто-зелена флуоресценція при флуоресцентно-мікроскопічних дослідженнях. Молекула барвника складається з бензтіазольного і амінобензольного кілець вільно обертаються навколо спільної С-С зв'язку. ., 2005). Кребс і співавтори показали, що молекула тіофлавіна Т зв'язується з амілоїдних фибриллами специфічно (Krebs et al., 2005). Вони припустили, що зв'язування відбувається в "каналах", які тягнуться вздовж β-шарів (рис. 7). . al ., 2005). Більш того, тіофлавін Т зв'язується з амілоїдних фибриллами так, що їх молекули паралельні один одному і розташовані вздовж довгої осі фібрили (Krebs et. Al., 2005). Було показано, що причиною зростання інтенсивності флуоресценції тіофлавіна Т при його зв'язуванні з амілоїдних фибриллами є жорсткість оточення, перешкоджає повороту бензтіазольного і амінобензольного кілець молекули один щодо одного в збудженому стані (Воропай і ін, 2003).

., 1989). Інший амілоїдних барвник Конго червоний також специфічно взаємодіє з амілоїдних фибриллами (Klunk et al., 1989). Конго червоний - сульфонірований азобарвник з гідрофобною центральною частиною, що складається з біфенільний групи, розташованої між негативно зарядженими кінцями молекули барвника (рис. 8). При зв'язуванні Конго червоного з амілоїдних фибриллами спостерігається зелене подвійне променезаломлення у поляризаційному мікроскопі, і ця властивість робить Конго червоний найбільш використовуваним барвником для діагностики амілоїдів. У спектральних дослідженнях реєструється зсув спектру поглинання Конго червоного в стані, пов'язаному з амілоїдних фибриллами, в довгохвильову область спектра, а саме від ~ 490 нм до ~ 500 нм.

Рис. 8. Модель зв'язування Конго червоного з амілоїдних фибриллами. – C направление. Показаний антипаралельних шар, де кожна п'ята ланцюжок білка має однакове N - C напрямок. Тому, молекула Конго червоного може зв'язуватися з таким же типом амінокислоти в обох поліпептидних ланцюгах (першої та п'ятої, як вказано на малюнку). Наступна молекула барвника зможе зв'язатися з третьої і сьомої ланцюжком і т.д. (Klunk et ., 1989). al., 1989).

Зв'язування амілоїдних фібрил з Конго червоним залежить від структури амілоїдних фібрил, а саме від наявності β-складчастої структури з окремими β-шарами. Кланк і співавтори запропонували модель зв'язування амілоїдних фібрил з Конго червоним допомогою зв'язків між двома негативно зарядженими сульфоновиє групами Конго червоного і двома позитивно зарядженими амінокислотними залишками двох окремих білкових молекул, які певним чином орієнтовані в β-складчастої структурі фібрил, утвореної за допомогою пліч-о-пліч розташованих окремих молекул (Klunk et ., 1989). al., 1989). Це означає, що білкові ланцюжки розташовані на відстані 4.7 Å. Більш того, кожна п'ята ланцюжок розташована від першої на відстані 19 Å. Це, приблизно, відповідає відстані між сульфоновиє групами КК (рис. 8). Дана модель показує специфічність взаємодії Конго червоного з амілоїдних фибриллами.

2.5. Патологічні прояви амілоїдозом

До теперішнього часу виділяють наступні форми амілоїдозом (Мягкова, 2000):

1. первинний (ідіопатичний) амілоїдоз - розвивається внаслідок нез'ясованих причин;

2. вторинний (набутий) амілоїдоз - розвивається як ускладнення після хронічних захворювань, при яких відбувається розпад тканин (туберкульоз, бронхоектатична хвороба, хронічний остеомієліт та ін);

3. спадковий (генетичний, сімейний) амілоїдоз - вроджене порушення білкового обміну;

4. старечий амілоїдоз.

З іншого боку, амілоїдоз поділяють на системний і локальний. Проте класифікація системного амілоїдозу заснована на специфічності основного амілоідного білка.

Зовнішній вигляд органів при амілоїдозі залежить від ступеня розвитку процесу. Якщо амілоїдні відкладення невеликі, зовнішній вигляд органа змінюється мало і амілоїдоз виявляється лише при гістологічному дослідженні. При вираженому амілоїдозі орган збільшується в об'ємі, ставати дуже щільним і ламким, а на зрізі має своєрідний воскоподібний або сальний вигляд.

До цих пір залишається невирішеним питання, що стосується механізму дії амілоїдних фібрил на органи і тканини. Дослідження останніх років показали, що амілоїдні агрегати різних білків і пептидів викликають порушення життєдіяльності клітин і їх загибель. ., 2003; Qahwash et al ., 2003; Sirangelo et al ., 2004; Lee et al ., 2006), однако неизвестно, чем обусловлена цитотоксичность этих агрегатов – механическим повреждением клеток, связанным с накоплением амилоидных отложений или особым молекулярным механизмом их взаимодействий внутри клетки. Як виявилося, цитотоксичні властивості проявляють все амілоїдні білки (Hashimoto et al., 2003; Qahwash et al., 2003; Sirangelo et al., 2004; Lee et al., 2006), проте невідомо, чим обумовлена ​​цитотоксичність цих агрегатів - механічним пошкодженням клітин, пов'язаних з накопиченням амілоїдних відкладень або особливим молекулярним механізмом їх взаємодій всередині клітини.

мета дослідження

. З'ясування здібності саркомерних білків сімейства тайтіна формувати амілоїдні фібрили in vitro.

завдання дослідження

1. . Вивчити агрегаційні властивості саркомерних білків сімейства тайтіна (тайтін, Х-, С-та Н-білки) in vitro.

2. Вивчити агрегаційні властивості А β (25-35) - пептиду в порівнянні з агрегацією молекул Х-білка.

3. Перевірити амілоїдних природу агрегатів, утворених досліджуваними білками, поляризаційної, флуоресцентної мікроскопією і спектральними методами.

4. Вивчити швидкість утворення амілоїдних фібрил.

Глава 3. Матеріали та методи дослідження

3.1. Експериментальний і клінічний матеріал

Експериментальний матеріал: кісткові м'язи і міокард кролика.

Клінічний матеріал: зразки міокарда пацієнта при ДКМП, узяті при проведенні операції з пересадки серця. Зразки міокарда людини були надані ФДМ НДІ трансплантології і штучних органів Росздрава (м. Москва).

3.2. Виділення та очищення білкових препаратів

3.2.1. Очищення С-білка, Х-білка і Н-білка

., 1973). Х-білок, С-білок і Н-білок очищали за методом (Offer et al., 1973). - Sephadex А-50, концентрировали сульфатом аммония до степени насыщения 2.08 М и осаждали центрифугированием в течение 1 часа при 3000 g . Фракції Х-, С-та Н-білків, отримані при хроматографічної очистки міозину скелетних м'язів на колонці з носієм DEAE - Sephadex А-50, концентрували сульфатом амонію до ступеня насичення 2.08 М і брали в облогу центрифугуванням протягом 1 години при 3000 g. , 4.8 м M K 2 HPO 4, 5.2 м M KH 2 PO 4, 0.1 мM ДТТ, 0.1 мM NaN3, pH 7.0, и диализовали против этого буфера до полного удаления сульфата аммония. Осад розчиняли в буфері, що містить 0.3 M KCl, 4.8 м M K 2 HPO 4, 5.2 м M KH 2 PO 4, 0.1 мM ДТТ, 0.1 мM NaN3, pH 7.0, і діалізовалі проти цього буфера до повного видалення сульфату амонію. Поділ білків проводили на колонці з гідроксиапатиту, врівноваженим в цьому ж буфері, для зняття білків з колонки використовували фосфатний градієнт. Така ж процедура очищення застосовувалася і для С-білка міокарда кролика і людини.

3.2.2. Виділення тайтіна з скелетних м'язів

., 1993) с модификациями. Тайтін з скелетних м'язів кролика виділяли за методом (Soteriou et al., 1993) з модифікаціями. , 5 м M ЭГТА, 1 м M NaHCO 3,, 1 м M ДТТ, 0.1 м M NaN 3, pH 7.0. М'язи гомогенізували в 3-х кратному (по відношенню до маси м'язів) об'ємі розчину, що містить 50 мМ KCl, 5 м M ЕГТА, 1 м M NaHCO 3,, 1 м M ДТТ, 0.1 м M NaN 3, pH 7.0. , 20 мкг/мл ингибитора трипсина, 10 мкг/мл леупептина. Для зменшення деградації тайтіна у процесі виділення в розчин додавали набір інгібіторів протеаз: 1 м M PMSF, 20 мкг / мл інгібітору трипсину, 10 мкг / мл леупептіна.

. Отриманий м'язовий гомогенат центрифугували протягом 5-10 хвилин при 2500 g. Супернатант відкидали, а процедуру промивання повторювали 5-6 разів. , 2 м M MgCl 2, 2 м M ЭГТА, 0.5 м M ДТТ, 0.1 мM NaN 3, 1 м M PMSF , 10 м M имидазола- HCl , pH 7.0. До промитому осадку додавали 2-х кратний обсяг екстрагують розчину, що містить 0.9 М KCl, 2 м M MgCl 2, 2 м M ЕГТА, 0.5 м M ДТТ, 0.1 мM NaN 3, 1 м M PMSF, 10 м M імідазолу-HCl, pH 7.0. Розчин також містив 40 мкг / мл соєвого інгібітору трипсину і 20 мкг / мл леупептіна.

Екстракція проводилася на льоду при 4 ˚ С протягом 10-15 хвилин при безперервному перемішуванні. и супернатант разбавляли в 3 раза охлажденной бидистиллированной водой, содержащей 0.1 м M ДТТ и 0.1 м M NaN 3, для преципитации актомиозина (конечная ионная сила ~0.2). Екстракт висвітлювали протягом 40 хвилин при 14000 g і супернатант розбавляли в 3 рази охолодженої бидистиллированной водою, що містить 0.1 м M ДТТ і 0.1 м M NaN 3, для преципітації актоміозіна (кінцева іонна сила ~ 0.2). . Через 1 годину супернатант висвітлювали протягом 60 хвилин при 20000 g. ДТТ и 0.1 м M NaN 3. Для осадження тайтіна супернатант розбавляли в 5 разів (кінцева іонна сила ~ 0.05) охолодженої бидистиллированной водою, що містить 0.1 м M ДТТ і 0.1 м M NaN 3. . Через 40-60 хвилин осад, що містить переважно тайтін, збирали центрифугуванням протягом 30 хвилин при 15000 g. , 30 м M KH 2 PO 4, 1 м M ЭГТА, 0.1 мM ДТТ, 0.1 мM NaN3, pH 7.0, и осветляли в течение 60 минут при 20000 g . Осад розчиняли в мінімальному обсязі буфера, що містить 0.6 М KCl, 30 м M KH 2 PO 4, 1 м M ЕГТА, 0.1 мM ДТТ, 0.1 мM NaN3, pH 7.0, і висвітлювали протягом 60 хвилин при 20000 g. – CL 2 B , уравновешенным в этом же буфере. Тайтін очищали методом гель-фільтрації на колонці з носієм Sepharose - CL 2 B, врівноваженим в цьому ж буфері.

3.3. Визначення концентрації білкових препаратів

, используя следующие значения коэффициентов экстинции (Е2801 мг/мл): 0.543 для доколоночного миозина ( Kielley & Harrington , 1960); 0.52 для колоночного миозина ( Godfrey & Harrington , 1970); 1.08 для актина ( Rees & Young , 1967); 1.37 для тайтина ( Trinick et al ., 1984); 1.09 для Х-белка, С-белка и Н-белка ( Starr & Offer , 1982). Концентрацію білків визначали спектрофотометрично за допомогою спектрофотометра SPECOD UV VIS, використовуючи такі значення коефіцієнтів екстінціі (Е2801 мг / мл): 0.543 для доколоночного міозину (Kielley & Harrington, 1960); 0.52 для колоночной міозину (Godfrey & Harrington, 1970); 1.08 для актину (Rees & Young, 1967); 1.37 для тайтіна (Trinick et al., 1984); 1.09 для Х-білка, С-білка і Н-білка (Starr & Offer, 1982).

3.4. Перевірка чистоти білкових препаратів

, 1970). Чистоту виділених препаратів міозину і актину скелетних м'язів кролика перевіряли за допомогою ДСН-гель-електрофорезу в 13% поліакриламідному гелі за методом (Laemmli, 1970).

Чистоту тайтіна, Х-білка, С-білка і Н-білка перевіряли за допомогою ДСН-гель-електрофорезу за методом (Fritz et al., 1989) з модифікаціями. буфер, pH 8.8, 0.1% ДСН, 10% глицерина, 0.05% тетраметилэтилендиамина и 0.05% персульфата аммония. Згідно з нашою методикою, що розділяє гель містив 7% поліакриламіду замість 15%, а також 0.75 М трис-HCl буфер, pH 8.8, 0.1% ДСН, 10% гліцерину, 0.05% тетраметілетілендіаміна і 0.05% персульфата амонію. ., 1970), содержащий 2.6–2.8% полиакриламида (соотношение акриламида к бис-акриламиду 36.5:1). Крім цього, замість концентруючого гелю з вмістом поліакриламіду 5% згідно (Fritz et al., 1989) застосовувався концентрує гель за методом (Laemmli et al., 1970), що містить 2.6-2.8% поліакриламіду (співвідношення акриламіду до біс-акриламіду 36.5:1 ). Ці модифікації сприяли кращому фокусуванню білкових смуг в гелі. буфер, pH 6.8, 0.1% ДСН, 0.05% тетраметилэтилендиамина и 0.05% персульфата аммония. Концентрує гель також містив 0.125 М трис-HCl буфер, pH 6.8, 0.1% ДСН, 0.05% тетраметілетілендіаміна і 0.05% персульфата амонію. Модифікований нами метод ДСН-гель-електрофорезу дозволив проводити електрофоретичного розділення білків з молекулярною вагою від 3 МДА до 100 кДа, що дало можливість дослідити спільне поведінка тайтіна, Х-білка, С-білка і Н-білка.

Електродний буфер при проведенні електрофорезу містив 0.192 М гліцину, 0.025 М трис і 0.1% ДСН, рН 8.3. Електрофорез проводили при струмі 3-5 мА перші 30-60 хвилин, після цього піднімали напругу до 12-15 мА. Після закінчення електрофорезу гелі фіксували в розчині, що містить 10% етанолу і 10% оцтової кислоти, протягом 20-30 хвилин. -250 и R -250 (смешанных в пропорции 1:1), 45% этанола и 10% уксусной кислоты. Потім гелі забарвлювали протягом 30-40 хвилин в розчині, що містить 0.1% Кумассі G -250 і R -250 (змішаних в пропорції 1:1), 45% етанолу і 10% оцтової кислоти. Відмивання забарвлених гелів проводилася в 7% оцтової кислоти при постійному перемішуванні на гойдалці протягом 40-50 хв.

3.5. Умови формування амілоїдних фібрил

Амілоїди формували діалізом розчинів білків протягом 20 годин при 4-37 ° С проти розчинів, що містять: 30 мМ KCl, 10 мМ імідазолу, рН 7.0; 0.15 М гліцин-КОН, рН 7.0; 0.15 М гліцин-KOH, рН 7.5, 25 мМ NaCI, 10 мМ Hepes, pH 7.0, 50 мM NaCl, 10 мM Hepes, pH 7.0; 30 мМ MgCI2, 10 мМ імідазолу, pH 7.0, 50 мM MgCl2, 10 мM імідазолу, pH 7.0.

, 10 мМ имидазола, рН 7.0 при температуре 4˚С. Для дослідження швидкості амілоідообразованія розчин Х-білка діалізовалі проти буфера, що містить 30 мМ KCl, 10 мМ імідазолу, рН 7.0 при температурі 4 ˚ С. Через певні проміжки часу відбирали проби для електронно-мікроскопічних та спектральних досліджень. , 10 мМ имидазола, рН 7.0 при температуре 4˚С. Для експериментів з дослідження цитотоксичності амілоїдних утворень Х-білок також инкубировали в розчині, що містить 30 мМ KCl, 10 мМ імідазолу, рН 7.0 при температурі 4 ˚ С.

3.6. Мікроскопічні дослідження

3.6.1 Електронна мікроскопія

Для приготування електронно-мікроскопічних зразків використовували препарати білків з концентраціями 0.1 мг / мл. - CHEM , USA ), укрепленной углеродом. Краплю розчину або суспензії білка наносили на мідні сітки, покриті коллодіевой плівкою (2% колодій в амілацетат фірми SPI - CHEM, USA), укріпленої вуглецем. Після видалення надлишку суспензії смужкою фільтрувального паперу зразки фарбували 2% водним розчином уранилацетатом.

Електронно-мікроскопічні дослідження проводили на мікроскопі JEM-100В при ускоряющем напрузі 80 кВ і збільшенні 30000х. Збільшення мікроскопа було тестовано за паракрісталлам параміозіна з періодичністю 14.5 нм.

3.6.2. Поляризаційна і флуоресцентна мікроскопія

Досліджувані зразки, наносилися на предметні скла і висушувалися на повітрі. , USA ) и затем исследовались на поляризационном микроскопе МКУ-1. Утворилися білкові плівки забарвлювалися 1% водним розчином Конго червоного (фірма SIGMA, USA) і потім досліджувалися на поляризаційному мікроскопі МКУ-1. , USA ) и исследовались с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-И 3. Зразки також забарвлювалися 1% водним розчином тіофлавіна Т (фірма SIGMA, USA) і досліджувалися за допомогою люмінесцентного мікроскопа ЛЮМАМ-І 3.

3.7. Спектральні методи

3.7.1. Метод кругового дихроїзму

Дослідження вторинної структури білка проводили методом кругового дихроїзму. Спектри кругового дихроїзму досліджуваних білків, до і після створення ними фібрил, реєстрували на спектрополяриметр Jasco -600, используя кварцевые кюветы с оптической длиной 0.1 см. Спектры КД были измерены в области 200–250 нм. J -600, використовуючи кварцові кювети з оптичною довжиною 0.1 див. Спектри КД були виміряні в області 200-250 нм. ( http://lamar.colostate.edu/~sreeram/CDPro/) . Обрахування спектрів КД в далекій ультрафіолетової області проводився з використанням програми CONTINLL (http://lamar.colostate.edu/ ~ sreeram / ​​CDPro /).

3.7.2. Метод флуоресцентного аналізу

Дослідження амілоїдної природи фібрил, а також дослідження швидкості амілоідообразованія було проведено з використанням класичного флуоресцентного барвника амілоїдних структур тіофлавіна Т (ТТ). Вимірювання флуоресценції проводили в розчині барвника (250 мкл) і суспензії фібрил (250 мкл) у відповідному буфері (буфер зазначений у підписах під малюнками у викладі результатів). Молярне співвідношення білка до барвнику становило 2:1. Інтенсивність флуоресценції розчину реєстрували за допомогою спектрофлуоріметри PERKIN-ELMER - 44B при довжині хвилі 488 нм і при довжині хвилі збудження 420 нм. Ширина щілини при порушенні 5 нм, а при реєстрації 10 нм. З отриманих значень інтенсивності флуоресценції тіофлавіна Т в буфері в присутності білка вичитали значення інтенсивності флуоресценції ТТ в буфері за відсутності білка, отримуючи інтенсивність флуоресценції ТТ, пов'язаного з білком.

3.7.3. Спектрофотометричний метод

Для підтвердження амілоїдної природи фібрил був також використаний специфічний барвник Конго червоний (КК). Суспензію фібрил (250 мкл) додавали до розчину КК (250 мкл) у відповідному буфері (буфер зазначений у підписах під малюнками у викладі результатів). Молярне співвідношення білка до барвнику становило 2:1. Спектри поглинання КК за відсутності та в присутності білка реєстрували при 450-650 нм за допомогою спектрофотометра SPECORD M 40.

. III. Результати та обговорення

Глава 4. освіта амілоїдних фібрил білками сімейства тайтіна

4.1. Електронно-мікроскопічне вивчення агрегаційну властивостей молекул тайтіна, Х-білка, С-білка і Н-білка скелетних м'язів кролика

проводят в условиях, которые часто не совместимы с условиями in vivo . Вивчення амілоідогенеза різних білків in vitro проводять в умовах, які часто не сумісні з умовами in vivo. Для утворення амілоїдних фібрил білками сімейства тайтіна ми використовували умови, близькі до фізіологічних. ., 1999; Goldsbury et al ., 2000; O'Nuallain et al., 2004; Uversky & Fink , 2004; см. рис. 5, 6). За допомогою електронної мікроскопії було показано, що досліджувані білки здатні формувати різні амілоїдні агрегати, як і інші відомі амілоідогенние білки (Chiti et al., 1999; Goldsbury et al., 2000; O'Nuallain et al., 2004; Uversky & Fink, 2004; див. рис. 5, 6).

Результати електронно-мікроскопічних досліджень представлені на рис. 9-14. Ми показали, що в розчині, що містить 30 мМ KCl, 10 мМ імідазолу, рН 7.0 Х-білок утворює спірально скручені стрічкові фібрили з осьовим періодичністю ~ 60-70 нм, шириною ~ 40 нм і довжиною більше 1 мкм (рис. 9 А) . Ми виявили, що такі ж структури Х-білок утворює і в розчині, що містить 0.15 М гліцин-КОН, рН 7.5 (рис. 9 Б). Крім цього Х-білок, а також С-білок і Н-білок утворюють аморфні агрегати, протофібрілли, лінійні фібрили і пучки лінійних фібрил в розчинах: 50 мM NaCl, 10 мM Hepes, pH 7.0, 25 мМ NaCI, 10 мМ Hepes, pH 7.0, 50 мM MgCl2, 10 мM імідазолу, pH 7.0; 30 мМ MgCI2, 10 мМ імідазолу, pH 7.0; 0.15 М гліцин-KOH, рН 7.5 (рис. 10-13).

На рис. 14 представлені електронні мікрофотографії пучка лінійних фібрил тайтіна скелетних м'язів кролика в розчині 0.15 М гліцин-KOH, рН 7.5. У цих умовах тайтін утворює щільні пучки лінійних фібрил довжиною ~ 3 мкм, шириною до 500 нм і аморфні агрегати. Ми спостерігали, що аморфні агрегати, протофібрілли довжиною 100-200 нм і діаметром ~ 3 нм, лінійні фібрили діаметром ~ 7 нм і пучки лінійних фібрил довжиною більше 3 мкм і шириною до 500 нм можуть знаходитись у одному і тому ж зразку. ., 1999; Goldsbury et al ., 2000). Це, мабуть, відображає різні стадії фібрилогенезу, характерні для формування амілоїдів (Kelly, 1998; Chiti et al., 1999; Goldsbury et al., 2000).

Для підтвердження амілоїдної природи фібрил тайтіна, Х-білка, С-білка і Н-білка наші подальші дослідження були спрямовані на порівняння агрегатів, утворених білками сімейства тайтіна, з агрегатами відомих амілоідогенних білків і, зокрема, А β-пептиду, що грає важливу роль у патогенезі хвороби Альцгеймера.

4.2. Електронно-мікроскопічне вивчення агрегаційну властивостей А β (25-35) - пептиду в порівнянні з агрегацією молекул Х-білка

Для порівняння спірально скручених фібрил Х-білка з іншими амілоїдних фибриллами ми вивчили агрегаційні властивості А β (25-35) - пептиду. Ми показали, що А β (25-35) - пептид, інкубувати протягом 24 год при 37 ˚ С утворює подібно Х-білку (рис. 15 А) спірально скручені стрічки кілька мікрон завдовжки і діаметром 25-27 нм з варіабельності осьовим періодом 170-250 нм (рис. 15 Б, В).

Стрічки побудовані з декількох довгих і вузьких фібрил діаметром 3-5 нм. На мікрофотографіях вони краще видно, якщо дивитися уздовж стрічки. Виявляються також листові агрегати (рис. 15 Г), сформовані за рахунок бічної агрегації більш коротких вузьких фібрил. Такі агрегати досягають завширшки ~ 50 нм. -пептида, найденными в мозге при болезни Альцгеймера. Таким чином, за допомогою електронної мікроскопії нами було встановлено морфологічне схожість фібрил Х-білка з амілоїду Aβ-пептиду, знайденими в мозку при хворобі Альцгеймера.

4.3. Підтвердження амілоїдної природи агрегатів, утворених білками сімейства тайтіна (тайтіна, Х-білка, С-білка і Н-білка) при їх взаємодії зі специфічними барвниками на амілоїди

Конго червоним і тіофлавіном Т

Основним методом виявлення амілоїдної природи фібрил, утворених різними білками, є їх здатність взаємодіяти зі специфічними барвниками Конго червоним і тіофлавіном Т (Klunk et ., 1989; LeVine, 1993, 1995; Krebs al., 1989; LeVine, 1993, 1995; Krebs et ., 2005). al., 2005). Саме ці барвники використовують в клінічній практиці для визначення амілоїдних відкладень in и для исследования амилоидогенеза in vivo і для дослідження амілоідогенеза in разными белками. vitro різними білками.

При фарбуванні Конго червоним фібрилярних структур, що формуються досліджуваними білками, ми спостерігали подвійне променезаломлення у поляризаційному мікроскопі, а при фарбуванні їх тіофлавіном Т - жовто-зелену флуоресценцію в люмінесцентному мікроскопі. На рис. 16 представлені дані зв'язування Х-фібрил, сформованих в розчині, що містить 30 мМ KCl, 10 мМ імідазолу, рН 7.0, з барвниками Конго червоним і тіофлавіном Т.

При спектральних дослідженнях інтенсивність флуоресценції тіофлавіна Т в присутності фібрил Х-, Н-і С-білків і тайтіна зростала в ~ 10, ~ 9, ~ 7 і ~ 5 разів відповідно в порівнянні з інтенсивністю флуоресценції барвника в присутності цих білків в молекулярній формі ( рис. 17). Незначне збільшення інтенсивності флуоресценції тіофлавіна Т спостерігається і в присутності молекулярних форм тайтіна, Х-, С-та Н-білків, що узгоджується з літературними даними для білків, що містять β-складчасту структуру (LeVine, 1993; 1995).

Рис. 17. , 30 мМ KH 2 PO 4, рН 7,0) и в присутствии фибрилл тайтина (0.15 М глицин- KOH , рН 7.5). Інтенсивність флуоресценції тіофлавіна Т (TT): А - в присутності молекулярного X-білка (в розчині, що містить 0.3 M KCl, 10 мМ К-фосфат, рН 7.0) і в присутності фібрил X-білка (0.15 М гліцин-KOH, рН 7.5 ); Б - у присутності молекулярного С-білка (0.3 M KCl, 10 мМ К-фосфат, рН 7.0) і в присутності фібрил С-білка (0.15 М гліцин-KOH, рН 7.5); В - у присутності молекулярного Н-білка (0.3 M KCl, 10 мМ К-фосфат, рН 7.0) і в присутності фібрил Н-білка (0.15 М гліцин-KOH, рН 7.5); Г - у присутності молекулярного тайтіна (0.6 М KCl, 30 мМ KH 2 PO 4, рН 7,0) і в присутності фібрил тайтіна (0.15 М гліцин-KOH, рН 7.5). Молярне співвідношення барвника та білка 1:2.

При вимірі спектральних характеристик розчину Конго червоного в присутності фібрил тайтіна, Х-, С-та Н-білків спостерігався зсув спектру поглинання барвника в довгохвильову область від ~ 490 нм до ~ 500 нм (рис. 18), що також є характерною рисою при зв'язуванні амілоїдних фібрил з Конго червоним (Klunk et ., 1989). al., 1989).

Рис. 18. Спектри поглинання вільного барвника показані лініями червоного кольору. Спектри поглинання барвника Конго червоного (лінія синього кольору): А - в присутності фібрил X-білка (в розчині, що містить 0.15 М гліцин-KOH, рН 7.5); Б - у присутності фібрил С-білка (0.15 М гліцин-KOH, рН 7.5); В - у присутності фібрил Н-білка (0.15 М гліцин-KOH, рН 7.5); Г - у присутності фібрил тайтіна (0.15 М гліцин-KOH, рН 7.5). Молярне співвідношення барвника та білка 1:2.

Проведені дослідження вказують на специфічність зв'язування барвників з фібрилярні агрегатами, утвореними білками сімейства тайтіна, підтверджуючи їх амілоїдних природу.

4.4. Вивчення вторинної структури тайтіна і білків його сімейства до і після створення амілоїдних фібрил

используется длительная икубация и условия, несовместимые с условиями in vivo (денатурирующие вещества, низкие значения рН, высокие температуры, добавление ряда веществ, не присутствующих в клетке и т.п.) ( Stine et al ., 2003). У роботах з вивчення освіти амілоїдних фібрил білками in vitro використовується тривала ікубація та умови, несумісні з умовами in vivo (денатуруючих речовини, низькі значення рН, високі температури, додавання ряду речовин, не присутніх в клітині і т.п.) (Stine et al ., 2003). Як відомо, ці умови призводять до трансформації структури молекули білка з утворенням β-складчастості, характерною для амілоїдних фібрил. ., 2005). (Juzczyk et al., 2005). & Kolmerer , 1995; Weber et al ., 1993; Vaughan et al ., 1993), молекулы белков семейства тайтина уже содержат β- складчатую структуру. Згідно з літературними даними (Labeit & Kolmerer, 1995; Weber et al., 1993; Vaughan et al., 1993), молекули білків сімейства тайтіна вже містять β-складчасту структуру. Нами були проведені дослідження вторинної структури білків до і після створення ними амілоїдних фібрил. Як показано на рис. 20 молекулярні і фібрилярні форми Х-, С-та Н-білків характеризуються подібними спектрами кругового дихроїзму (КД). Форма спектрів фібрил свідчить на користь того, що в їх складі практично відсутні α-спіральні ділянки, а переважаючими елементами є β-складки. Молекулярна форма тайтіна містить ~ 10% α-спіралі. Після утворення амілоїдних фібрил молекула тайтіна містить тільки β-структуру (рис. 19).

Рис. 19. Спектри кругового дихроїзму (КД) в дальній УФ-області: А - Х-білка;

Б - С-білка; В - Н-білка; Г - тайтіна. , 30 мМ KH 2 PO 4, рН 7.0) показаны линией красного цвета. Спектри КД молекулярних форм Х-, С-, Н-білків (в розчині, що містить 0.3 M KCl, 10 мМ К-фосфат, рН 7.0) і молекулярної форми тайтіна (0.6 М KCl, 30 мМ KH 2 PO 4, рН 7.0) показані лінією червоного кольору. Спектри КД фібрил Х-, С-, Н-білків і тайтіна (0.15 М гліцин-KOH, рН 7.5) показані лінією синього кольору.

Зрозуміло, що за наявності у цих білків β-складчастої структури, необхідної для утворення амілоїдних фібрил, полегшується процес формування ними амілоїдів in и увеличивается опасность их быстрого роста в клетке. vitro і збільшується небезпека їх швидкого зростання в клітці.

4.5. Швидкість утворення амілоїдних фібрил Х-білка

характеризуются разной скоростью ( Kim et al ., 2002; Stine et al ., 2003; Hwang et al ., 2004). Процеси формування амілоїдних фібрил різними білками in vitro характеризуються різною швидкістю (Kim et al., 2002; Stine et al., 2003; Hwang et al., 2004). Швидкість фібріллообразованія може залежати від багатьох факторів: складу розчинів, температури, рН, та ін Але найбільший вплив робить, швидше за все, тип вторинної структури білка. Якщо білок містить високий відсоток α-спіралі, то потрібно трансформація типу "α-спіраль - β-складчастість" (рис. 4). Так як білки сімейства тайтіна вже містять β-складчасту структуру, то немає необхідності в зміні вторинної структури. Швидкість утворення амілоїдних структур білками сімейства тайтіна була продемонстрована на прикладі Х-білка, так як він утворює найбільш впорядковані амілоїдні структури та методом електронної мікроскопії можна візуально оцінити, як відбувається процес фібріллообразованія. , 1993). Паралельно швидкість утворення амілоїдних фібрил Х-білком оцінювалася за їх зв'язування з флуоресцентним барвником тіофлавіном Т, який широко використовується в якості маркера амілоїдів (LeVine, 1993).

У зразках білка відбувалося накопичення їх амілоїдних структур, про що свідчить зростання флуоресцентного сигналу тіофлавіна Т. Результати представлені на рис. 20. Не відбувається значного збільшення інтенсивності флуоресценції тіофлавіна Т при зв'язуванні з Х-білком в перші години інкубації (1-4 години), так як фібрили ще не сформовані, а присутні аморфні агрегати (рис. 20 А). При подальшій інкубації інтенсивність флуоресценції тіофлавіна Т зростала (рис. 20 Г), що відповідало утворенню амілоїдних фібрил, серед яких спостерігаються і аморфні агрегати (рис. 20 Б). Після 22 годин діалізу інтенсивність флуоресценції барвника при зв'язуванні з фибриллами досягала плато флуоресцентної кривої, що узгоджується з даними електронної мікроскопії: відзначається присутність добре сформованих спірально скручених стрічкових фібрил Х-білка (рис. 20 В). Вони спостерігаються і після 26 годин діалізу.

Рис. 20. , 10 мМ имидазола, рН 7.0. А - аморфні агрегати Х-білка (4 години діалізу), Б - лінійні фібрили і аморфні агрегати Х-білка (17 годин діалізу), В - спірально скручені стрічкові фібрили Х-білка (22 години діалізу), сформовані в розчині, що містить 30 мМ KCl, 10 мМ імідазолу, рН 7.0. Негативний фарбування 2% розчином уранилацетатом. Шкала 100 нм. Г - швидкість утворення амілоїдних фібрил Х-білка.

Для багатьох амілоідогенних білків також характерна тимчасова залежність освіти амілоїдних фібрил. ., 1999). Наприклад, м'язова ацілфосфатаза здатна формувати аморфні агрегати після перших годин інкубації в присутності тріфлуороетанола при рН 5.5 і температурі 25 ˚ С, і тільки через 45 днів з'являються пучки фібрил (Chiti et al., 1999). ., 2003). А β (1-40) - пептид при рН 7.2, температурі 37 ˚ С у присутності 0.1% оцтової кислоти після 4 годин інкубації утворює аморфні агрегати і тільки після 48 годин - довгі фібрили (Qahwash et al., 2003). структура их молекул должна претерпевать трансформацию типа " α- спираль – β- складчатость", что, как правило, требует длительной инкубации и жестких условий, не совместимых с условиями in vivo (низкие значения рН, высокие температуры, добавление ряда веществ, не присутствующих в клетке и т.п.). Експерименти з багатьма білками показали, що перед освітою амілоїдів in vitro структура їх молекул повинна зазнавати трансформацію типу "α-спіраль - β-складчастість", що, як правило, вимагає тривалої інкубації і жорстких умов, не сумісних з умовами in vivo (низькі значення рН, високі температури, додавання ряду речовин, не присутніх в клітині і т.п.). Згідно з результатами нашого дослідження, освіта амілоїдних фібрил Х-білком відбувається в м'яких умовах (рН 7.0, температура 3-5 ° С, іонна сила, близька до фізіологічної) і швидше, ніж у випадку м'язової ацілфосфатази людини і А β (1-40) - пептиду. , что указывает на возможность быстрого роста его амилоидных депозитов in vivo . Слід також зазначити, що на відміну від інших білків, наявність 90% β-складчастої структури у Х-білка сприяє його швидкої агрегації в амілоїдні фібрили in vitro, що вказує на можливість швидкого зростання його амілоїдних депозитів in vivo.

4.6. Освіта амілоїдних фібрил С-білком міокарда людини при ДКМП і С-білком міокарда кролика

Амілоїдні депозити нерідко виявляються в серці і кровоносних судинах при кардіоміопатіях і міокардитах. Особливо слід відзначити амілоїдоз серця (кардіопатіческій амілоїдоз або амілоїдна кардіоміопатія), який, як стверджують медичні фахівці (Сторожаков та ін, 2000), на жаль, не включається в схему диференційного діагнозу навіть при резистентної до лікування серцевої недостатності і діагностується посмертно. З огляду на все перераховане вище, ми вирішили перевірити, чи може С-білок, виділений з серця пацієнта з дилатаційною кардіоміопатією, утворювати амілоїдні фібрили. Дилатаційна кардіоміопатія (ДКМП) - захворювання міокарда невідомої етіології, діагностується з розширення (дилатації) лівого, правого чи обох шлуночків. Порушується систолічна функція шлуночків, можливий розвиток застійної серцевої недостатності, часто спостерігається порушення ритму шлуночків і передсердь. У ході розвитку ДКМП серце поступово, але необоротно, втрачає свою функціональну активність (Хубутія, 2001; Шумаков та ін, 2003).

, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 0.01 М К-фосфат, pH 7.0; 30 мМ CaCl 2, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 30 мМ NaCl , 10 мМ имидазола, рН 7.0; 30 мМ MgCl 2, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 50 мМ MgCl 2, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 0.15 М глицин-КОН, рН 7.0) С-белок миокарда человека образует аморфные агрегаты и пучки линейных фибрилл длиной до 3 мкм и шириной до 500 нм (рис. 21 Г). Наші дослідження показали, що в різних розчинах (30 мМ KCl, 10 мМ імідазолу, рН 7.0; 0.01 М К-фосфат, pH 7.0; 30 мМ CaCl 2, 10 мМ імідазолу, рН 7.0, 30 мМ NaCl, 10 мМ імідазолу, рН 7.0; 30 мМ MgCl 2, 10 мМ імідазолу, рН 7.0, 50 мМ MgCl 2, 10 мМ імідазолу, рН 7.0; 0.15 М гліцин-КОН, рН 7.0) С-білок міокарда людини утворює аморфні агрегати і пучки лінійних фібрил довжиною до 3 мкм і шириною до 500 нм (рис. 21 Г).

З-білок міокарда кролика в тих же умовах утворює аморфні агрегати і пучки лінійних фібрил довжиною більше 2 мкм і шириною до 500 нм (рис. 21 А-В). Амілоїдна природа фібрил С-білка міокарда людини і кролика була підтверджена поляризаційної та флуоресцентної мікроскопії, а також спектральними методами при взаємодії їх з Конго червоним і тіофлавіном Т (Марсагішвілі та ін, 2006).

. Таким чином, за допомогою різних специфічних тестів ми показали, що білки сімейства тайтіна здатні формувати амілоїди in vitro. Подальші наші дослідження мають бути спрямовані на тестування токсичних властивостей амілоїдів цих білків, на пошук підходів до їх руйнування і запобігання їх утворення.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Барсуков А., Шустов С., Шкодкін І., Воробйов С., Проніна Е. (2005) Гіпертрофічна кардіоміопатія і амілоїдоз серця / / Лікар Вип. 10. С. 42-46.

2. Виноградова О.М. (1980) Первинний і генетичні варіанти амілоїдозу / / М. Медицина 224 с.

3. Віхлянцев І.М. (2005) Вивчення тайтіна і білків його сімейства в скелетних м'язах в нормі, при глибокого сну та мікрогравітації / / дисертаційна робота. Пущино. 105 з.

4. Віхлянцев І.М., Макаренко І.В., Халіна Я.М., Удальцов С.М., Малишев С.Л., Підлубний З.А. (2000) Зміни ізоформного складу цитоскелетного білка тайтіна - адаптаційний процес при глибокого сну / / Біофізика. Т. 45. Вип. 5. С. 831-835.

5. Віхлянцев М ., Алексеева І. М., Алексєєва А ., Шпагина Ю.., Шпагіна Д ., Удальцов М. Д., Удальцов Н ., Подлубная С. Н., Підлубний А . З. А. Изучение (2002) Вивчення властивостей белка С - білка скелетних і серцевих м'язів на ховрахів Citellus undulatus на різних стадіях зимової Биофизика . Т. сплячки / / Біофізика. Т. 47. Вип. 4. С. 701-705.

6. Віхлянцев І.М., Підлубний З.А., Шенкман Б.С., Козловська І.Б. (2006) Поліморфізм тайтіна скелетних м'язів при екстремальних умовах зимової сплячки і мікрогравітації: діагностична цінність ізоформ тайтіна для вибору підходів до корекції "гіпогравітаціонного м'язового синдрому" / / Докл. Акад. Наук. Т. 407. № 5. С. 692-694.

7. Гурівське М.М., Єрьомін А.В., Газенко О.Г., Єгоров А.Д., Брянов І.І., Генін А.М. (1975) Медичні дослідження в космічних польотах кораблів «Союз-12, 13, 14," та орбітальній станції «Салют-3» / / Космічна програма. Біол. і мед. № 2. С. 48-53.

8. во время пробуждения // Биофизика. Лукоянове Н.А., Шпагіна М.Д., Удальцов С.М., Ігнатьєв Д.А., Колаева С.Г., Підлубний З.А (1996) Зміни в структурній організації реконструйованих ниток міозину з скелетних м'язів зімоспящіх ховрахів Citellus undulatus під час пробудження / / Біофізика. Т. 41. С. 116-122.

9. Макаренко І.В., Шпагіна М.Д., Вишневська З.І., Підлубний З.А. (2002) Зміна структури та функціональних властивостей цитоскелетного еластичного білка тайтіна при дилатаційною кардіоміопатії / / Біофізика. Т. 47. Вип. 4. С. 706-710.

10. Макаренко І.В. (2004) Роль поліморфізму тайтіна в регуляції структурно-функціональних властивостей міокарда в нормі і при патології / / Дисертаційна робота. Пущино. 107 с.

11. Марсагішвілі Л.Г., Осипова Д.А., Віхлянцев І.М. (2006) С-білок міокарда людини утворює амілоїдні фібрили / / Тези доп. Дев'ятий Всеросійської медико-біологічної конференції молодих вчених «Людина та її здоров'я», 22 квітня, Санкт-Петербург, С. 207.

12. Мягкова Л.П. (2000) Ентеропатіческій амілоїдоз: особливості клінічних проявів, місце серед інших форм амілоїдозу. / / Клінічна медицина. № 1. С. 11-14.

13. Підлубний З.А. (1981) Формування скорочувальних структур у міогенезе / / В кн.: Проблеми міогенеза. Л. с. 51-74.

14. Сторожаков Г.І., Гендлін Г.Є. (2000) Амілоїдоз серця / / Серцева недостатність. Т. 1. № 1.

15. Фрейдіна Н.А., Орлова О.А., Підлубний З.А. (1980) Електронно-мікроскопічне дослідження структури С-білка і його взаємодії з міозином, фрагментами міозину і актином / / В кн.: Структурні основи та регулювання біологічної рухливості. М. 160-163 с.

16. Хубутія М.Ш. (2001) Дилатаційна кардіоміопатія / / Вісник трансплантології і штучних органів, № 3-4. C. 32-40.

17. Шубнікова Е.А., Юріна Н.А., Гусєв Н.Б., Балезіно О.П., Большакова Г.Б. (2001) М'язові тканини / / М: Медицина. 240 с.

18. Шумаков В.І., Хубутія М.Ш., Іллінський І.М. (2003) Дилатаційна кардіоміопатія / / ТОВ «Видавництво Тріада». 448 с.

19. Alyonycheva TN, Mikawa T., Reinach FC, Fischman DA (1997) Isoform-specific interaction of the myosin-binding proteins (MyBPs) with skeletal and cardiac myosin is a property of the C-terminal immunoglobulin domain / / J Biol Chem. V. 272 (33). P. 20866-20872.

20. Bahler M., Moser H., Eppenberger HM, Wallimann T. (1985) Heart C-protein is transiently expressed during skeletal muscle development in the embryo, but persists in cultured myogenic cells / / Develop. Biol. V. 112. P. 345-352.

21. Bauer HH, Aebi U., Haner M., Hermann R., Muller M, Merkle HP (1995) Architecture and polymorphism of fibrillar supramolecular assemblies prodused by in vitro aggregation of human calcitonin. / / J. Struct. Biol. V. 115. P. 1-15.

22. Bennett P., Craig R., Starr R., Offer G. (1986) The ultrastructural location of C-protein, X-protein and H-protein in rabbit muscle / / J. Muscle. Res. & Cell Motil. V. 7 (6). P. 550-567.

23. Bennett P., Starr R., Elliott A., Offer G. (1985) The structure of C-protein and X-protein molecules and a polymer of X-protein / / J. Mol. Biol. V. 184. P. 297-309.

24. Blake CCF, Serpel LC (1996) Synchrotron X-ray studies suggest that the core of the transtyretin amyloid fibrils is a continuous β-sheet helix / / Structure V. 4. P. 989-998.

25. Blake CCF, Serpel LC Sunde M., Sangren O., Lundgren E. (1996) A molecular model of the amyloid fibrils. The nature and origin of amyloid fibrils. / / Ciba Found. Simp. V. 199. P. 6-21.

26. Callaway JE, Bechtel PJ (1981) C-protein from rabbit soleus (red) muscle / / Biochem. JV 195. P. 463-469.

27. (1999) Designing conditions for in vitro formation of protofilaments and fibrils // PNAS V. Chiti F., Webster P., Taddei N., Clark A., Stefani M., Ramponi G., Dobson Ch. (1999) Designing conditions for in vitro formation of protofilaments and fibrils / / PNAS V. 96. P. 3590-3594.

28. Dobson CM (2001) The structural basis of protein folding and its links with human disease / / Phil. Trans. Roy. Soc. Ser. BV 356. P. 133-145.

29. Draper MH, Hodge AJ (1949) Electron microscopy of muscle / / Austr. J. Exp. Biol. Med. Sci. V. 27. P. 465-483.

30. Fandrich M., Fletcher MA, Dobson SM (2001) Amyloid fibrils from muscle myoglobin / / Nature V. 410. P. 165-166.

31. Flashman E., Redwood C., Moolman-Smook J., Watkins H. (2004) Cardiac myosin binding protein C: its role in physiology and disease / / Circ. Res. V. 94 (10). P. 1279-1289.

32. Franzini-Armstrong G., Porter KR (1964) Sarcolemmal invaginations constituting the T-system in fish muscle tiber / / J. Cell Biol. V. 22. P. 675-696.

33. Freiburg A., Gautel M. (1996) A molecular map of the interactions between titin and myosin binding protein C. Implications for sarcomeric assembly in familial hypertrophic cardiomyopathy / / Eur. J. Biochem. V. 235. P. 317-323.

34. Biochem. Fritz JD, Swartz DR, Greaser ML (1989) Factors affecting polyacrilamide gel electrophoresis and electroblotting of high-molecular-weight myofibrillar proteins / / Analyt. Biochem. V. 180. P. 210. 205 - 210.

35. Funatsu T., Kono E., Higuchi H., Kimura S., Ishiwata S., Yoshioka T., Maruyama K., Tsukita S. (1993) Elastic filaments in situ in cardiac muscle: deep-etch replica analysis in combination with selective removal of actin and myosin filaments / / J. Cell Biol. V. 120. P. 711-724.

36. Fürst DO, Osborn M., Nave R., Weber K. (1988) Th e organization of titin filaments in the half-sarcomere revealed by monoclonal antibodies in immunoelectron microscopy: a map of ten nonrepetitive epitopes starting at the Z line extends close to the M line / / J. Cell Biol. V. 106. P. 1563-1572.

37. Fürst DO., Vinkemeier U., Weber K. (1992) Mammalian skeletal muscle C-protein: purification from bovine muscle, binding to titin and the characterization of a full-length human cDNA / / J Cell Sci. V. 102. P. 769-778.

38. Glenner G., Eanes E., Bladen H., Linke R. (197 4) β-plated sheet fibrils. A comparison of native amyloid with synthetic protein fibrils / / J. Histochem. Cytochem. V. 22. P. 1141-1158.

39. Godfrey JE, Harrington WF (1970) Self-association in the myosin system at high ionic strength. II. Evidence for the presence of a monomer-dimmer equilibrium / / Biochemistry. V. 9 (4). P. 894-908.

40. Goedert M. α -Synuclein and neurodegenerative diseases // Nature Rev. (2001) α-Synuclein and neurodegenerative diseases / / Nature Rev. V. Neurosci. V. 2. P. 501. 492 - 501.

41. Goldsbury CS, Wirtz S., Müller SA, Sunderji S., Wicki P., Aebi U., Frey P. (2000) studies on the in vitro assembly of Aβ (1-40): implications for the search for Aβ fibril formation inhibitors / / J. of Struct. Biol. V. 130. P. 217-231.

42. Gregorio CC, Granzier H., Sorimachi H., Labeit S. (1999) Muscle assembly: a titanic achievement? / / Curr. Opin. Cell Biol. V. 11. P. 18-25.

43. Guijarro JI, Sunde M., Jones JA, Campbell ID, Dobson CM (1998) Amyloid fibril formation by an SH3 domain / / Proc. Natl. Acad. Sci. USA V. 95. P.4224-4228.

44. Hanson J., O'Brien EJ, Bennett PM (1971) Structure of the myosin-containing filament assembly (A-segment) separated from frog skeletal muscle / / J. Mol. Biol. V. 58. P. 865-871.

45. Hartzell HC (1985) Effects of phosphorylated and unphosphorylated C-protein on cardiac actomyosin ATPase / / J. Moll. Biol. V. 186. P. 185-195.

46. Hartzell HC, Glass DB (1984) Phosphorylation of purified cardiac muscle C-protein by purified cAMF-dependent and endogenous Ca2 +-calmodulin-dependent protein kinases / / J. Biol. Chem. V. 259. P. 15587-15596.

47. Hartzell HC, Titus L. (1982) Effect of cholinergic and adrenergic agonists on phosphorylation of a 165000-dalton myofibrillar protein in intact amphibian cardiac muscle / / J. Biol. Chem. V. 257. P. 2111-2120.

48. Hashimoto M., Rockenstein E., Crews L., Masliah E. (2003) Role of protein aggregation in mitochondrial dysfunction and neurodegeneration in Alzheimer's and Parkinson's diseases / / Neuromolekular Med. V. 4. P. 21-36.

49. Houmeida A., Holt J., Tskhovrebova L., Trinick J. (1995) Studies of the interaction between titin and myosin / / J. Cell Biol. V. 131. P. 1471-1481.

50. Hwang W., Zhang Sh., Kamm RD, Karplus M. (2004) Kinetic control of dimmer structure formation in amyloid fibrillogenesis / / PNAS V. 101. P. 12916-12921.

51. Improta S., Politou AS, Pastore A. (1996) Immunoglobulin-like modules from titin I-band: extensible components of muscle elasticity / / Structure V. 4. P. 323-337.

52. Itoh Y., Kimura S., Suzuki T., Ohashi K., Maruyama K. (1986) Native connectin from porcine cardiac muscle / / J. Biochem. V. 100. P. 439-447.

1. Jeacocre SA, England PJ (1980) Phosphorylation of a myofibrillar protein of Mr 150000 in perfused rat heart, and the tentative identification of this as C-protein / / FEBS Letters. V. 122. P. – 132. 129 - 132.

2. Juszczyk P., Kolodziejczyk AS, Grzonka Z. (2005) Circular dichroism and aggrega tion studies of amyloid β (11-28) fragment and its variants / / Acta Biochim. Pol. V. 52. P. 425-431.

3. Kelly JW (1998) The alternative conformations of amyloidogenic proteins and their multi-step assembly pathways / / Curr. Opin. Struct. Biol. V. 8. P. 101-106.

4. Kielley WW, Harrington WF (1960) A model for the myosin molecule / / Biochim. Biophys. Acta. V. 41 (3). P. – 421. 401 - 421.

5. Kim Y., Randolph TW, Stevens FJ, Carpenter JF (2002) Kinetics and energetics of assembly, nucleation, and growth of aggregates and fibrils for an amylodogenic protein / / J. Biol. Chem. V. 277. P. 27240-27246.

6. Klunk WE, Pettegrew JW, Abraham DJ (1989) Quantitative evaluation of Congo red binding to amyloid-like proteins with a beta-pleated sheet conformation / / J. Histochem. Cytochem. V. 37. P. 1273-1281.

7. Koretz JF, Irving TC, Wang K. (1993) Filamentous aggregates of native titin and binding of C-protein and AMP-desaminase / / Arch. Biochem. Biophys. V. 304 (2). 305-309.

8. Krebs MR, Bromley EH, Donald AM (2005) The binding of thioflavin-T to amyloid fibrils: localisation and implications. / / J. Struct. Biol. V. 149. P. 30-37.

9. Kulikovskaya I., McClellan G., Flavigny J., Carrier L., Winegrad S. (2003) Effect of MyBP-C binding to actin on contractility in heart muscle / / J. Gen. Physiol. V. 122 (6). – 774. 761 - 774.

10. (2000) Myosin binding protein C, a phosphorylation-dependent force regulator in muscle that controls the attachment of myosin heads by its interaction with myosin S2 // Circ Res. Kunst G, Kress KR, Gruen M, Uttenweiler D, Gautel M, Fink RH. (2000) Myosin binding protein C, a phosphorylation-dependent force regulator in muscle that controls the attachment of myosin heads by its interaction with myosin S2 / / Circ Res. V. 86 (1). P. – 58. 51 - 58.

11. Labeit S. & Kolmerer B. (1995) Titins, giant proteins in charge of muscle ultrastructure and elasticity / / Science. V. 270. P. – 296. 293 - 296.

12. Laemmli H. (1970) Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacterophage T4 / / Nature. V. 227 (5259). P. 680-685.

13. Lee EK, Park YW, Dong Y.Sh., Mook-Jung I., Yoo Yu. J. (2006) Cytosolic amyloid-β peptide 42 escaping from degradation induces cell death / / Biochem. Biophys. Res. Communs. V. 344. P. 471-477.

14. LeVine III H. (1993) Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer's disease β-amyloid peptides: detection of amyloid aggregation in solution / / Prot. Sci. V. 2. P. 404-410.

15. LeVine III H. β -sheet structures // Amyloid. V. (1995) Thioflavine T interactions with amyloid β-sheet structures / / Amyloid. V. 2. P. 6. 1 - 6.

16. Lim MS, Sutherland C., Walsh MP (1985) Phosphorylation of bovine cardiac C-protein by protein kinase C / / Biochem. Biophys. Res. Communs. V. 132. P. – 1195. 1187 - 1195.

17. Linke WA, Kulke M., Li H., Fujita-Becker S., Naegoe C., Manstein DJ, Gautel M., Fernandez JM (2002) PEVK domain on titin: an entropic spring with actin-binding properties / / J. Struct. Biol. V. 137. P. 194-205.

18. Liversage AD, Holmes D., Knight PJ, Tskhovrebova L., Trinick J. (2001) Titin and the sarcomere symmetry paradox / / J. Mol. Biol. V. 305. P. – 409. 401 - 409.

19. Maruyama K., Kimura S., Ohashi K., Kuwano Y. (1981) Connectin, an elastic protein of muscle. Identification of "titin" with connectin / / J. Biochem. V. 89. P. 701-709.

20. Maruyama K., Matsubara R., Natori Y., Nonomura S., Kimura S., Ohashi K., Murakami F., Handa S., Eguchi G. (1977) Connectin, an elastic protein of muscle / / J. Biochem. V. 82. P. – 337. 317 - 337.

21. McClellan G., Kulikovskaya I., Winegrad S. (2001) Changes in cardiac contractility related to calcium-mediated changes in phosphorylation of myosin-binding protein C / / Biophys. JV 81 (2). P. 1083-1092.

22. McClellan G., Kulikovskaya I., Flavigny J., Carrier L., Winegrad S. (2004) Effect of cardiac myosin-binding protein C on stability of the thick filament / / J. Mol. Cell Cardiol. V. 37 (4). P. 823-835.

23. Mohamed AS, Dignam JD, Schlender KK (1998) Cardiac myosin-binding protein C (MyBP-C): identification of protein kinase A and protein kinase C phosphorylation sites / / Arch. Biochem. Biophys. V. 358 (2). P. 313-319.

24. Moos C. (1981) Fluorescence microscope study of the binding of added C-protein to skeletal muscle myofibrils / / J. Cell Biol. V. 90 P. 25-31.

25. Moos C., Dubin J., Mason C., Besterman J. (1976) Binding of C-protein to F-actin / / Biophys. JV 16. P. 47a.

26. Moos C., Mason CM, Besterman JM, Feng IN. M., Dubin JH (1978) The binding of skeletal muscle C-protein to F-actin and its relation to the interaction of actin with myosin subfragment-1 / / J. Mol. Biol. V. 124. P. 571-586.

27. Moos C., Offer G., Starr R., Bennett P. (1975) Interaction of C-protein with myosin, myosin rod and light meromyosin / / J. Mol. Biol. V. 97. P. – 9. 1 - 9.

28. Muhle-Goll C., Pastore A., Nilges M. (1998) The 3D structure of a type I module from titin: a prototype of intracellular fibronectin type III domains / / Structure. V. 6. P. 1291-1302.

29. Nave R., Furst DO, Weber K. (1989) Visualization of the polarity of isolated titin molecules: a single globular head on a long thin rod as the M band anchoring domain? / / J. Cell Biol. V. 109. P. 2177-2187.

30. Offer G., Moos C., Starr R., (1973) A new protein of the thick filaments of vertebrate skeletal myofibrils. Extraction, purification and characterization / / J. Mol. Biol. V. 74. P. 653-676.

31. O'Nuallain B., Williams AD, Westermark P., Wetzel R. (2004) Seeding specificity in amyloid growth induced by heterologous fibrils / / J. Biol. Chem. V. 279. P. 17490-17499.

32. Pepe FA (1967) The myosin filament. I. Structural organization from antibody staining observed in electron microscopy / / J. Mol. Biol. V. 27. P. – 225. 203 - 225.

33. Podlubnaya ZA, Freydina NA, Lednev VV (1990) The axial repeats in paracrystals of light meromyosin and its complex with C-protein / / Gen. Physiol. Biophts. V. 9. P. 301-310.

34. Qahwash I., Weiland K., Lu Yi., Sarver R., Kletzien R., Yan R. (2003) Identification of a mutant amyloid peptide that predominantly forms neurotoxic protofibrillar aggregates / / J. Biol. Chem. V. 278. P. 23187-23195.

35. Rees MK, Young M. (1967) Studies on the isolation and molecular properties of homogenous globular actin. Evidence for a single polypeptide chain structure / / J. Biol. Chem. V. 242 (19). P. 4449-4458.

36. Safer D., Pepe FA (1980) Axial packing in light meromyosin paracrystals / / J. Mol. Biol. V. 136. P. 343-358.

37. Sato N., Kawakami T., Nakayama A., Suzuki H., Kasahara H., Obitana T. (2003) A novel variant of cardiac myosin-bihding protein-C that is unable to assemble into

38. Shirahama T., Cohen AS (1967) High-resolution electron microscopic analysis of the amyloid fibril. / / J. Cell. Biol. V. 33. P. 679-708.

39. Sipe JD, Cohen AS (2000) History of the amyloid fibril. / / J. Struct. Biol. V. 130. P. 88-98.

40. Siragelo I., Malmo C., Iannuzzi C., Mezzogiorno A., Bianco. R., Papa M., Irace G. (2004) Fibrillogenesis and cytotoxic activity of the amyloid-forming apomyoglobin mutant W7FW14F / / J. Biol. Chem. V. 279. P. 13183-13189.

41. Soteriou A., Gamage M., Trinick J. (1993) A survey of interactions made ​​by the giant protein titin / / J. Cell Sci. V. 14. P. 119-123.

42. Squire JM (1981) The structural basis of muscular contraction / / New York. London. P. 349.

43. Starr R. & Offer G. (1971) Polypeptide chains of intermediate molecular weight in myosin preparations / / FEBS Lett. V. 15. P. 40-44.

44. Starr R. & Offer G. (1983) H-protein and X-protein. Two new components of the thick filaments of vertebrate skeletal muscle / / J. Mol. Biol. V. 170. P. – 698. 675 - 698.

45. Starr R., Offer G. (1978) Interaction of C-protein with heavy meromyosin and subfragment-2 / / Biochem. JV 171. P. 813-816.

46. Starr R., Offer G. (1982) Preparation of C-protein, H-protein, X-protein and phosphofructokinase / / In: Methods in enzymology. New York. London. V. 85. – 138. Part BP 130 - 138.

47. Stine WB, Dahlgren KN, Krafft GA, LaDu MJ (2003) In vitro characteriza tion for amyloid-β peptide oligomerization and fibrillogenesis / / J. of Biol. Chem. V. 278. P. 11612-11622.

48. Stelzer J., Patel J., Moss R. (2006) Protein kinase A-medieted acceleration of the stretch activation responce in murine skinned myocardium is eliminated by ablation of cMyBP-C / / Circ. Res. V. 13. P. 884-890.

49. Sunde M., Blake CCF (1997) The structure of amyloid fibrils by electron microscopy and X-ray diffraction. / / Adv. Prot. Chem. V. 50. P. 123-159.

50. Suzuki J., Kimura S., Maruyama K. (1994) Electron microscope filament lengths of connectin and its fragments / / J. Biochem. V. 116. P. – 410. 406 - 410.

51. Suzuki K., Terry RD (1967) Fine structural localization of acid phosphatase in senile plaques in Alzheimer's presenile dementia. / / Acta Neuropathol. (Berl.). V. 8. P. 276-284.

52. Tan SY, Perys MB (1994) Histopahtology / / Amyloidosis. V. 25. P. 403-414.

53. Trinick J., Knight P., Whiting A. (1984) Purification and properties of native titin / / J. Mol. Biol. V. 180. P. 331-356.

54. Tskhovrebova L., Trinick J. (1997) Direct visualization of extensibility in isolated titin molecules / / J. Mol. Biol. V. 265. P. 100-106.

55. Uversky VN, Fink AL (2004) Conformational constraints for amyloid fibrillation: the importance of being unfolded / / Biochim. Biophys. Acta. V. 1698. P. 131-153.

56. Vaughan KT, Weber FE, Einheber S., Fichman DA (1993) Molecular cloning of chiken myosin-binding protein (MyBP) H (86-kDa protein) reveals extensive homology with MyBP-C (C-protein) with conserved immunoglobulin C2 and fibronectin type III motifs. / / J. Biol. Chem. V. 268. P. 3670-3676.

57. Wang K., McClure J., Tu A. (1979) Titin: major myofibrillar components of striated muscle / / Proc.Natl Acad. Sci.USA. V. 76 (8). P. 3698-3702.

58. Wang K & Wright J. (1988) Architecture of the sarcomere matrix of skeletal muscle: immunoelectron microscopic evidence that suggests a set of parallel inextensible nebulin filaments anchored at the Z-line / / J Cell Biol. V. 107 (6 Pt 1). P. 2199-212.

59. Weber FE, Vaughan KT, Reinach FC, Fischman DA (1993) Complete sequence of human fast-type and slow-type muscle myosin-binding-protein C (MyBP-C). Differential expression, conserved domain structure and chromosome assignment / / Eur J Biochem. V. 216 (2). – 669. P.661 - 669.

60. Weisberg A., Winegrad S. (1996) Alteration of myosin cross bridges by phosphorylation of myosin-binding protein C in cardiac muscle / / Proc. Natl. Acad. Sci. US AV 93 (17). P. – 9003. 8999 - 9003.

61. Weisberg A., Winegrad S. (1998) Relation between crossbridge structure and actomyosin ATPase activity in rat heart / / Circ Res. V. 83 (1). P. – 72 60 - 72

62. Yamamoto K. & Moos K. (1983) The C-protein of rabbit red, white, and cardiac muscles / / J. Biol. Chem. V. 258 (13). P. 8395-8401.

63. Yamamoto K. (1984) Characterization of H-protein, a component of skeletal muscle myofibrils / / J. Biol. Chem. V. 259. P. 7163-7168.

64. Zerovnik E. (2002) Amyloid fibril formation / / Eur. J. Biochem. V. 269. P. 3362-3371.